克隆过程中的注意事项 (克隆过程中的酶是什么)

克隆过程中的注意事项与酶的作用解析

一、克隆技术的概述

克隆技术，作为一种在生物学领域具有重要意义的科技手段，指的是通过无性繁殖方式产生遗传上完全相同的生物个体。
自其诞生以来，克隆技术一直备受关注，其在生物医药、农业、生物保护等领域的应用前景广阔。
克隆技术也涉及许多复杂的过程和注意事项，尤其是在实际操作中，对于酶的使用更是需要严谨和精细。

二、克隆过程中的注意事项

1. 实验室环境的安全性

克隆实验必须在严格的实验室条件下进行，确保实验室环境的安全性是首要任务。
实验室应具备相应的生物安全设施和设备，以防止任何可能的生物泄漏事故。
实验室人员需接受相关的生物安全培训，确保他们具备处理潜在风险的能力。

2. 实验材料的选择与处理

克隆实验中所使用的材料（如细胞、组织等）必须经过严格的筛选和处理。
材料的来源必须可靠，且经过严格的检测，确保其无疾病污染和无遗传异常。
对于材料的处理过程也需要精细操作，避免任何可能的污染和损伤。

3. 技术操作的规范性

克隆实验的技术操作必须遵循规范，确保每一步操作都准确无误。
操作过程中的任何失误都可能导致实验失败，甚至引发严重的后果。
因此，实验室人员需要接受严格的技术培训，确保他们具备规范操作的能力。

三、克隆过程中的酶是什么

在克隆过程中，酶发挥着至关重要的作用。
酶是一种生物催化剂，能够加速生物化学反应的速度，而不改变反应的总能量变化。
在克隆过程中，酶的主要作用包括：

1. 切割DNA：在克隆过程中，需要使用特定的酶（如限制性内切酶）来切割DNA，以便将目的基因从原始DNA序列中分离出来。
2. 连接DNA：在切割完DNA后，需要使用连接酶将目的基因与载体DNA连接起来，形成重组DNA分子。
3. 促进细胞分裂：在某些克隆过程中，需要使用细胞分裂相关的酶（如蛋白激酶）来促进细胞的分裂和生长，从而提高克隆效率。

四、酶在克隆过程中的作用及选择依据

1. 酶的作用

在克隆过程中，酶的主要作用是催化生物化学反应，加速DNA的切割、连接和细胞分裂等过程。
没有酶的参与，这些过程将无法进行或进行得非常缓慢。
因此，酶在克隆过程中起着至关重要的作用。

2. 酶的选择依据

在选择酶时，需要考虑以下几个方面：酶的活性、特异性、稳定性和来源。
活性是指酶的催化效率；特异性是指酶对底物的选择性；稳定性是指酶在各种条件下的耐受性；来源则是指酶的获取途径和成本。
根据克隆实验的具体需求和条件，选择合适的酶是提高实验成功率的关键。

五、总结

克隆技术作为一种前沿科技手段，在诸多领域具有广泛的应用前景。
在克隆过程中，实验室环境的安全性、实验材料的选择与处理以及技术操作的规范性都是需要注意的事项。
同时，酶作为克隆过程中的重要生物催化剂，其选择和使用也是关键的一环。
通过深入了解克隆过程中的注意事项和酶的作用及选择依据，我们可以更好地应用克隆技术，为生物医药、农业、生物保护等领域的发展做出贡献。

---

基因克隆的基本步骤有哪些

基因克隆的基本步骤流程如下：

一、目的DNA片段的获得：

DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。

由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。 若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。 如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。

二、载体的选择：

基因克隆常用的载体有：质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、单链DNA噬菌体载体、噬粒载体及酵母人工染色体等。 从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体、表达载体、测序载体、穿梭载体等。

三、体外重组：

体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。 大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。

当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰；

如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。

四、导入受体细胞：

载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。

五、重组子的筛选：

从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：

（1）插入失活法：外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。 常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。

（2）PCR筛选和限制酶酶切法：提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。 PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。

（3）核酸分子杂交法：制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。 目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。

（4）免疫学筛选法：获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。 这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。

扩展资料：

基因克隆的注意事项：

1、平端连接：DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。 原则上讲，限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互连接；若产生的粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。

2、加尾连接：同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。 在末端转移酶作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。 这是一种人工提高连接效率的方法，也属于粘性末端连接的一种特殊形式。

3、人工接头连接：对平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将磷酸化的接头(linker)或适当分子连到平端，使产生新的限制性内切酶位点。 再用识别新位点的限制性内切酶切除接头的远端，产生粘性末端。

简述DNA重组与分子克隆化基本原理与过程

（一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５磷酸和相邻的3羟基之间形成的新的共价链。 如质粒载体的两条链都带5磷酸，可生成４个新的磷酸二酯链。 但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。 在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口（图1.8），当杂本导入感受态细胞后可被修复。 相邻的５磷酸和３羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶。 实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的用酶。 这是因为在下述反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。 不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。 现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。 在加作用的底物。 如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。 这样，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。 如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。 因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。 Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物性质的影响。 简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。 j是ＤＮＡ分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。 这样，j与ＤＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。 j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ长度，以cm计，b是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。 b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响ＤＮＡ的刚度。 i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里Ｎo是阿佛伽德罗常数，Ｍ是ＤＮＡ的摩尔浓度（单位：mol/L)。 理论上，当j=i时，给定ＤＮＡ分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。 因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。 而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。 图1.9显示了ＤＮＡ区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk等，1985）。 现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。 对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响。 当i是j的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源ＤＮＡ末端浓度的２倍时，有效重组体的产量可达到最大。 这些条什下，连接反应终产物的大约40％都是由单体质粒与外源ＤＮＡ所形成的嵌合体。 当连接混合物中线性质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源ＤＮＡ的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。 涉及带粘端的线状磷酸化质粒ＤＮＡ的连接反应应包含：１）足量的载体ＤＮＡ，以满足j:i>1和j:i<3。 对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体ＤＮＡ为20-60μg/ml。 ２）末端浓度等于或稍高于载体ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。 这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。 如用磷酸酶处理线状质粒ＤＮＡ或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。 (二）粘端连接 １）用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。 如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。 通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。 ２）按如下所述设立连接反应混合物：a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源ＤＮＡ。 b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃。 c．加入：10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液 １μlＴ４噬菌体ＮＤＡ连接酶 0.1Weiss单位５mmol/L ATP 1μl于16℃温育１－４小时10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液200mmol/L同(pH7.6)50mmol/K MgCl250mmol/L二硫苏糖醇500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ｖ产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。 另外，再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。 如果外源ＤＮＡ量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。 可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。 大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，)对该酶进行标化。 １个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化１mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]ATP所需酶时，１个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位（如Ｎew England Biolabs公司所定义）。 因此，0.015Ｗeiss单位的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶在16℃下30分钟内可使50％的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。 在本书中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶一律用Weiss单位表示。 \par 目前提供的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/L (pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀释成100单位/ml的浓度置存。 处于这种浓度并在这种缓冲液中的Ｔ４噬体ＤＮＡ连接酶于-20℃保存３个月可保持稳定。 ３）每个样品各取１－２μl转化大肠杆菌感受态细胞。 （三）平端ＤＮＡ连接Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。 有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。 然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下４个条件：１）低浓度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。 ２）不存在亚精胺一类的多胺。 ３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。 ４）高浓度的平端。 １．凝聚剂在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致ＤＮＡ分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解。 在连接反应中，这些物质具有两作用：１）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行。 ２）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。 这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的ＤＮＡ浓度下，所有的ＤＮＡ产物也将是线状多聚体。 \par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。 （１）聚乙二醇（PEG8000）１）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。 在含15％PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。 除PEG 800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。 ２）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至ATP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。 ３）浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。 ４）PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。 （２）氯化六氨合高钴１）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。 当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。 氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。 ２）在单价阳离子（30mmol/L KCl）存在下，它对平端连接仍有一定的刺激作用，但此时连接产物的分布有所改变。 连接产物不再是清一色的分子间连接产物，相反，环状ＤＮＡ将点尽优势。 ３）与ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高钴不能显著提高合成寡核苷酸的连接速率。 （四）质粒载体中的快速克隆质粒克隆中最慢的步骤是所需的外源ＤＮＡ片段和相应质粒ＤＮＡ区段的电泳纯化，下面的操作方案[由(个人通讯）根据Struhl(1985)的方法修订而成]是从纯化的凝胶中回收琼脂糖块，熔化后直接进行质粒和外源ＤＮＡ的连接。 这一方法寻平端连接和粘端连接都同样奏效，但需大量的连接酶，而且效率要比标准操作方案约低一个数量级。 １）用适当的限制酶消化外源ＤＮＡ，其量应足以产生约0.2μg的靶片段。 反应体积应为20μl或更小。 在另一管中，用相应的限制酶消化约0.5μg载体ＤＮＡ，总反应体积为20μl或更小。 如载体ＤＮＡ带相同的端，应用磷酸处理如下：用限制酶消化完全后，加2.5μl 100mmol/L (pH8.3)、10mmol/L ZnCl2,加0.25单位牛小肠碱性磷酸酶，于37℃温育30分钟。 ２）通过琼脂糖凝胶电泳分离目标片段。 务必用低熔点琼脂糖灌制凝胶，务必用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的１xTAE作为电泳缓冲液而不是常规的0.5xTBE来配制凝胶并进行电泳。 ３）在长波长紫外照射下检查凝胶，根据目标条带的相对荧光强度估计所含ＤＮＡ的量（见附录Ｅ）。 用刀片切出目标条带，尽可能少琼脂糖的体积（通常40-50μl)。 将切下凝胶片分别放入作好标记的各个微量离心管中。 ４）于70℃加热10-15分钏，使琼脂糖熔化。 ５）合并熔化的小份凝胶并放到加温至37℃的中一管中，共终体积应不超过10μl,外源ＤＮＡ与质粒载体的摩尔比应接近２：１。 用另外两个管设立两个对照连反应，一个只含质粒载体，另一个只含外源ＤＮＡ片段。 ６）将３个管于37℃温育5-10分钟，然后每管加10μl用冰预次的２xT４噬体ＤＮＡ连接酶混合物，在琼脂糖凝固前，充他混匀各管内容物，于16℃温育12-16小时。 ２xT４噬菌体ＤＮＡ连接酶混合物可制备如下：1mol/L (pH7.6) 1.0μl100mmol/L氯化镁 1.0μl200mmol/L三硫苏糖醇 1.0μl10mmol/L ATP 1.0μl水 5.5μlＴ４噬菌体ＤＮＡ连接酶 １Ｗeiss单位混匀后放置于冰浴上。 ７）连接反应行将结束时，取出贮存于-70的３管各200μl的冻存大肠杆菌感受态细胞８）于70℃中热10-15分钟重新溶化连接混合物中的琼脂糖。 ９）立即从每管连接混全物中取出５μl加到200μl大肠杆菌感受态细胞中，小心摇晃，快速地混匀内容物。 从剩下每管连接混合物中分别再取５μl重复以上步骤，将转化混合物在冰浴上放置30分钟。 10）完成转化方案的其余各步 分子克隆化是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。 常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。 克隆(clone,clon)一词源于希腊文Klon，原意为树木的枝条。 在生物学中其名词含义系指一个细胞或个体以无性繁殖的方式产生一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传性状，常称无性繁殖(细胞)系；其动词(clone,cloned,cloning)含义指在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中，即分子克隆技术。 将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。 cDNA克隆是以mRNA为原材料，经体外反转录合成互补的DNA(cDNA)，再与载体DNA分子连接引入寄主细胞。 每一cDNA反映一种mRNA的结构，cDNA克隆的分布也反映了mRNA的分布。 特点是：①有些生物，如RNA病毒没有DNA，只能用cDNA克隆；②cDNA克隆易筛选，因为cDNA库中不包含非结构基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一个mRNA的信息；③cDNA能在细菌中表达。 cDNA仅代表某一发育阶段表达出来的遗传信息，只有基因文库才包含一个生物的完整遗传信息。 分子克隆化-方法(1)DNA片段的制备：常用以下方法获得DNA片段：①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段；③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下，用人工方法合成对应的基因片段；④从mRNA反转录产生cDNA。 (2)载体DNA的选择：①质粒：质粒是细菌染色体外遗传因子，DNA呈环状，大小为1-200千碱基对(kb)。 在细胞中以游离超螺旋状存在，很容易制备。 质粒DNA可通过转化引入寄主菌。 在细胞中有两种状态，一是“紧密型”；二是“松驰型”。 此外还应具有分子量小，易转化，有一至多个选择标记的特点。 质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段，适用于构建原核生物基因文库，cDNA库和次级克隆。 ②噬菌体DNA：常用的λ噬菌体的DNA是双链，长约49kb，约含50个基因，其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的，分布在噬菌体DNA两端。 中间是非必需区，进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。 λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。 M13噬菌体是一种独特的载体系统，它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌，但不裂解寄主菌。 M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子，象质粒一样自主制复，制备方法同质粒。 寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体，又能方便地制备单链DNA，用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。 ③拷斯(Cos)质粒：是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。 是噬菌体－质粒混合物。 此类载体分子容量大，可携带45kb的外源DNA片段。 也能象一般质粒一样携带小片段DNA，直接转化寄主菌。 这类载体常被用来构建高等生物基因文库。 (3)DNA片段与载体连接：DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一，方法有：①粘性末端连接，DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。 在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。 ②平头末端连接，用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。 平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端连接。 ④人工接头分子连接，在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。 连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。 以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。 以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1∶1。 (4)引入寄主细胞：常用两种方法：①转化或转染，方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上，待DNA被吸收后铺在平板培养基上，再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子，通常重组分子的转化效率比非重组DNA低，原因是连接效率不高，有许多DNA分子无转化能力，而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大，转化困难。 ②转导，病毒类侵染宿主菌的过程称为转导，一般转导的效率比转化高。 (5)克隆的选择：①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。 例如：有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮；还有些载体分子携带外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化，如蓝色变为无色；有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌，携带外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。 ②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。 如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。 因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。 ③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。 方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。 阳性点的位置就是所需要的克隆。 ④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。 分子克隆化-重要意义分子克隆技术是70年代才发展起来的，它的出现和应用开辟了分子遗传学研究的新领域，打开了人类了解、识别、分离和改造基因，创造新物种的大门。 它的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。 在医学方面，利用分子克隆技术已将胰岛素，人、牛和鸡的生长激素、人的干扰素、松驰素、促红细胞生长激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因制成工程菌，利用发酵工业进行了大规模生产。 还可提高微生物本身所产生的蛋白酶类和抗生素类药物的产量。 在基因治疗方面。 通过遗传工程看到癌细胞具有逆转为正常细胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠肿瘤细胞，在温度高时可逆转为正常细胞。 为治疗半乳糖血症，用带有大肠杆菌乳糖操纵子的λ噬菌体去感染半乳糖血症患者的离体培养细胞，发现这种细胞的半乳糖苷酶达到了正常水平，并确实能代谢半乳糖。 在工业生产方面，以分子克隆技术为主体的基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，四者紧密联系、常综合利用。 许多化学试剂如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、环氧乙烷、乌头酸和水杨酸等都可能利用分子克隆技术得到产品。 在环境保护方面，人们根据需要进行基因操作，将某种微生物的基因转入另一微生物，创造一些对有害物质降解能力更强的新菌种，以分解工业污水中的有毒物质。 在食品工业方面，细菌可为人类生产有价值的蛋白质、氨基酸和糖等。 在农业生产方面，植物遗传工程对提高农作物的产量、培育新的农作物品种提供了可能。 有许多外源基因导入植物获得成功。

简述利用DNA重组技术在大肠杆菌细胞中克隆外源基因的基本过程？

利用DNA重组技术在大肠杆菌细胞中克隆外源基因的基本过程通常包括以下步骤：